2018年9月份的Nature旗下期刊Emerg Microbes Infect发表了晶诺生物客户南京医科大学第二附属医院冯旰珠主任医师的文章Rv2346c enhances mycobacterial survival within macrophages by inhibiting TNF-α and IL-6 production via the p38/miRNA/NF-κB pathway。这是晶诺生物结核分枝杆菌基因敲除及回补菌株产品首次出现在已发表的高水平论文当中。
研究背景
结核分枝杆菌侵染巨噬细胞过程中激活巨噬细胞TLR2信号通路，促使NF-κB进入细胞核并调控巨噬细胞TNFα、IL6等蛋白的表达，TNFα、IL6等能与被感染细胞的相应受体结合并启动细胞凋亡途径，最终实现结核分枝杆菌的清除。除了TNFα、IL6外，miRNAs在结核分枝杆菌感染巨噬细胞过程中起着重要的调控功能。然而，结核分枝杆菌拥有多种逃脱免疫监控的系统，ESX分泌系统中的ESAT-6就是其中的一部分。ESAT-6能够打破吞噬体，使其中的结核分枝杆菌被释放到巨噬细胞细胞质中，是结核分枝杆菌重要的毒力因子之一。Rv2346c是ESAT-6家族蛋白成员，有研究报道Rv2346c有助于结核分枝杆菌在巨噬细胞中存活，能够促进活性氧的生成并导致宿主细胞基因组的不稳定性[1]，然而Rv2346c的具体分子机制仍不清楚。
实验方案
实验结果
1、Rv2346c抑制感染了BCG菌株的巨噬细胞的增殖并增强BCG菌株在巨噬细胞中的存活
Rv2346c蛋白与BCG菌株共同处理U937或RAW264.7细胞24h、48h、72h、96h，后通过CCK-8 assay、CFU assay分别检测巨噬细胞、结核分枝杆菌数目变化。结果表明，高感染复数（high multiplicity of infections）的BCG菌株或高浓度的Rv2346c能够抑制巨噬细胞的增殖；Rv2346c有助于BCG菌株在巨噬细胞中的存活，但随着细胞培养时间的延长，BCG菌株数目仍呈下降趋势。
Fig1. 不同感染复数BCG菌株、不同浓度Rv2346c对巨噬细胞复制及BCG菌株存活的影响
2、Rv2346c对 TNFα、IL6、 p38磷酸化、p65、miR-155、miR-99b的影响
TNFα、IL6参与巨噬细胞清除结核分枝杆菌，为了研究Rv2346c是否能通过抑制TNFα、IL6的生成来影响巨噬细胞清除结核分枝杆菌的功能，研究人员用Rv2346c与BCG菌株共同处理巨噬细胞后， 对巨噬细胞TNFα、IL6含量进行了Elisa检测，结果表明，在Rv2346c存在条件下巨噬细胞TNFα、IL6生成明显减少。
p38、p65蛋白能够调控TNFα、IL6的生成，Western blot实验表明Rv2346c促进p38的磷酸化，抑制p65表达；qRT-PCR实验表明Rv2346c抑制p65基因转录。
真核细胞中的蛋白表达受到miRNAs的调控，为了研究结核分枝杆菌感染巨噬细胞过程中参与的miRNA，研究人员用微阵列数据分析方法（Microarray data analysis）对miRNAs进行了分析。结果表明Rv2346c处理后，miRNA-155、 miRNA-99b含量明显上升。
Fig2. Rv2346c对 TNFα、IL6、 p38磷酸化、p65、miR-155、miR-99b的影响
3、p65促进TNFα、IL6的生成，但不影响p38磷酸化及miRNA的生成
为了研究p65如何影响TNFα、IL6等的表达，研究人员对p65进行了过表达及RNA干扰实验，结果表明p65过表达能促进TNFα、IL6等的表达，而p65 RNA干扰后TNFα、IL6等的表达被抑制。进一步研究p65过表达或RNA干扰对BCG菌株存活的影响，结果表明p65过表达减弱BCG菌株存活而p65干扰实验结果相反。在Rv2346c存在时，p65过表达产生的影响能被减弱。
Fig3. p65过表达及RNA干扰对TNFα、IL6及BCG菌株存活的影响
4、miR-155、miR-99b下调p65、TNFα、IL6的表达，但对p38磷酸化无影响
BCG菌株感染巨噬细胞后miR-155、miR-99b含量显著上升，研究人员认为二者可能参与了NF-κB的激活或p38的磷酸化，miR-155、miR-99b过表达及RNA干扰实验表明miR-155、miR-99b能抑制p65、TNFα、IL6的表达。
Fig4. miR-155、miR-99b对p65、TNFα、IL6表达影响
5、p38调控 miRNA转录及p65、TNFα、IL6的表达
为了明确p38在BCG菌株感染巨噬细胞过程中的功能，研究人员进行了p38的过表达及RNA干扰实验，结果表明p38能促进miRNA转录并对p65、TNFα、IL6表达具有抑制功能。
Fig5. p38对miRNA、p65、TNFα、IL6的影响
上述体外实验表明Rv2346c能通过p38/miRNA/NF-κB信号通路抑制TNFα、IL6的表达，那么Rv2346c在体内又如何影响结核分枝杆菌的毒力及TNFα、IL6的表达呢？
6、Rv2346c对结核分枝杆菌毒力影响
BCG菌株、H37Ra、ΔRv2346c（上海晶诺生物科技有限公司构建）、H37Rv、ΔRv2346c/ΔRv2346c::pMV261（上海晶诺生物科技有限公司构建）等菌株处理C57BL/6小鼠，处理55天后统计小鼠存活数目。收集小鼠肺部组织，统计感染后结核分枝杆菌数目，HE染色进行组织观察并统计病变情况。结果表明Rv2346c能增强结核分枝杆菌毒力。
Fig6. Rv2346c对结核分枝杆菌毒力影响
7、Rv2346c对小鼠TNFα、IL6表达具有抑制功能
PBS、ΔRv2346c、H37Rv处理C57BL/6小鼠，35天后收集肺部组织并对TNFα、IL6进行免疫荧光检测，结果表明Rv2346c能抑制TNFα、IL6的表达。
Fig7. Rv2346c对小鼠TNFα、IL6的表达影响
实验结论
一系列的实验表明Rv2346c能通过p38/miRNA/NF-κB信号通路抑制TNFα、IL6的表达，是结核分枝杆菌重要的毒力因子，是抗结核研究的靶点之一。
总结图：Rv2346c调控TNFα、IL6表达模式图
参考文献
1. Mohanty S, Dal Molin M, Ganguli G, Padhi A, Jena P, Selchow P, Sengupta S, Meuli M, Sander P, Sonawane A. Mycobacterium tuberculosis EsxO (Rv2346c) promotes bacillary survival by inducing oxidative stress mediated genomic instability in macrophages. Tuberculosis (Edinb). 2016 Jan;96:44-57.
2. Yao J, Du X, Chen S, Shao Y, Deng K, Jiang M, Liu J, Shen Z, Chen X, Feng G. Rv2346c enhances mycobacterial survival within macrophages by inhibiting TNF-α and IL-6 production via the p38/miRNA/NF-κB pathway. Emerg Microbes Infect. 2018 Sep 19;7(1):158.
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思路延伸
这篇论文揭示了Rv2346c能够影响p38，我们来看看细胞中p38信号通路，继续深入研究可能会发现更新奇的现象，如：
- Rv2346c 如何激活p38的磷酸化？
- 结核分枝杆菌除了结合TLR2受体，是否还能与别的细胞膜受体如Fasl受体结合？
- p38信号通路下游分子如CHOP、Histone H3（与基因组稳定性相关，难道是Rv2346c影响巨噬细胞基因组稳定性的原因？）等是否也受影响等等？
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