结核分枝杆菌是一种胞内病原菌，能够运用多种策略干预宿主细胞的正常功能，从而逃逸宿主免疫反应，进而实现其在宿主细胞中的长期存活。
病原菌与宿主间相互博弈的动态过程及分子机理为抗结核治疗、药物研发等提供了新思路和特异性靶点。巨噬细胞与结核分枝杆菌的相互作用是结核病发病的关键环节，抑制巨噬细胞凋亡是结核分枝杆菌逃逸宿主免疫的重要途经，因此研究结核与宿主巨噬细胞间的相互作用至关重要。
下面和大家分享一篇由刘翠华、戈宝学老师为通讯作者在Cellular & Molecular Immunology 上发表的综述文章。
在这篇综述中，全面、系统地总结了结核分枝杆菌先天免疫逃避机制，以促进其自身的细胞内生存。
该文回顾了：
1、结核菌调控宿主的细胞内核酸受体信号通路；
2、结核分枝杆菌如何绕过宿主细胞固有免疫策略，如膜转运及膜完整性、细胞死亡和自噬；
3、结核菌操纵宿主先天免疫分子调节机制的策略，包括核内调节机制、泛素系统和细胞固有免疫成分。可以帮助我们更好地理解结核分枝杆菌和宿主先天免疫系统之间复杂的相互作用，为了解结核发病机制提供新的见解，并有助于疫苗开发和结核病治疗。
一、胞质核酸感应途径
1-1 宿主免疫识别结核菌的胞质核酸感应途径
感染后，Mtb 被吞噬细胞内化为吞噬体，在宿主胞质内释放细菌 DNA 和 RNA。胞质传感器 cGAS、IFI204、AIM2 识别结核菌 DNA，而 NLRP3、NOD2、RIG-I、MDA5、PKR 识别RNA。活化的胞质 DNA/RNA 传感器进一步诱导炎症小体或 NF-κB 和 IRF3 介导的先天免疫通路的激活，以调节宿主抗结核菌反应。
二、宿主固有免疫策略
结核菌激活宿主细胞免疫途径，导致一系列的抗菌作用，如细胞吞噬、凋亡等，然而这些作用可以被 Mtb 防御和调节，使得自身在细胞中长期生存。
Mtb 的调控策略：干预宿主细胞膜转运及膜完整性、细胞死亡、自噬过程，如图1-2所示：
1-2 Mtb感染期间宿主细胞的免疫反应
a、Mtb 调节细胞膜转运及膜完整性：(1)结核菌促进Rab5+、Rab11+而抑制 Rab7+、Rab20+的核内体募集到吞噬小体。(2)抑制溶酶体融合，引起吞噬体损伤，使其逃逸到宿主细胞质。(3)结核菌诱导线粒体膜通透性转变 (MPT)，抑制宿主细胞膜修复，调节 ejectosome 形成和外泌体运输。
b、细胞死亡：在 Mtb 感染过程中，可能会诱导细胞死亡模式，其中凋亡和焦亡被认为可抑制细菌胞内生长，促进抗结核免疫反应，而坏死性凋亡和铁死亡则有利于结核分枝杆菌的复制和传播。此外，中性粒细胞胞外诱捕 (NET) 相关 NETosis 可能诱捕结核杆菌，并促进免疫细胞相互作用。
c、细胞自噬：xenophagy 和 LAP 途径都有助于宿主自噬相关的免疫清除。xenophagy 途径可通过结核菌和 Mtb 吞噬体的 E3 泛素连接酶（Parkin 和 smurf1）泛素化或通过 Mtb 表面蛋白 Rv1468c 的结合；LAP 途径由 NOX2 和 RUBCN 介导，促进 LC3 在 Mtb 吞噬体上的募集。然而，Mtb 可以通过调节宿主miRNA或使用一系列的蛋白效应子 (如 ESX-1、SapM、EIS 和 CpsA) 来破坏 xenophagy 和 LAP 途径。
三、结核菌调节宿主先天免疫机制
Mtb 通过宿主-病原体分子相互作用来操纵宿主细胞固有免疫应答的调控机制，如图1-3所示：
1-3 Mtb效应分子靶标宿主细胞和固有免疫的分子调控机制
在感染后，Mtb 将多种效应蛋白传递到宿主细胞中，与宿主泛素系统的分子组分和其它固有细胞免疫蛋白直接相互作用，从而破坏宿主固有免疫。同时，一些 Mtb 效应蛋白被确定为核调节素，它们进入宿主细胞核，参与宿主先天免疫应答的表观遗传和转录调控。
1、Mtb靶向核内免疫调节机制：
（1）一些Mtb核调节素作为组蛋白修饰酶参与宿主免疫反应的表观遗传调控。目前，已确定的靶向和修饰宿主组蛋白的 Mtb效应因子有 EIS、Rv1988、Rv3423.1。
- 感染过程中，EIS 增加组蛋白 H3 的乙酰化水平以调节宿主自噬激活。
- Rv1988 定位于宿主染色质，作为一种功能性的甲基转移酶，可对 H3R42 上的精氨酸残基进行二甲基化，以抑制一系列参与活性氧 (ROS) 产生的宿主基因。
- Rv3423.1 表现出组蛋白乙酰转移酶活性，并靶向宿主 H3K9 和 H3K14。
（2）其它 Mtb 核调节素
- Rv2966c 是一种5-甲基胞嘧啶特异性 DNA 甲基转移酶，主要参与宿主基因组 DNA 的甲基化，主要是感染非 CpG 胞嘧啶。
- 一些 Mtb 蛋白效应物表现出双重调控功能，不仅针对宿主的胞质成分，而且模仿参与宿主核内过程的真核转录因子。① 分泌蛋白 PPE2 通过 SH3 样结构域直接与宿主 NADPH 氧化酶的胞质亚基 p67phox 相互作用；PPE2 还可以与 NOS2 启动子结合，限制宿主 ROS 的产生。② PtpA 被送入宿主细胞质，抑制宿主炎症免疫反应，也可以进入感染细胞的细胞核，与多种宿主基因（如 GADD45A）结合并调节其表达，从而影响细胞的增殖和迁移。
2、Mtb 靶点：宿主泛素系统
（1）Mtb泛素结合蛋白 Rv1468c 位于细菌表面，它直接招募宿主胞质泛素，触发 xenophagy，限制宿主炎症反应。
（2）Mtb PtpA 通过一个独特的泛素互作基元样区域与泛素直接相互作用，激活宿主 p-JNK、p-p38 和 p-VPS33B 去磷酸化，从而抑制先天免疫应答。
（3）PtpA 与宿主 E3 泛素连接酶（包含TRIM27的三部分基元）的RING结构域结合，以对抗TRIM27促进的炎症免疫反应和细胞凋亡。
（4）Mtb 分泌蛋白 Rv0222，与宿主 E3 泛素连接酶 ANAPC2结合，介导 Rv0222 的 k11 连接泛素化，从而抑制宿主 NF-κB 激活。
（5）Mtb 分泌的毒力因子 LpqN 与 E3 泛素连接酶 CBL 相互作用，CBL 在细胞对感染的内在反应中发挥调节作用。
（6）Mtb 分泌的毒力因子 Rv3354 能够与 CSN5 相互作用，导致 cullin-RING 不稳定。
越来越多的证据表明，泛素系统经常被入侵的病原体吸收，然后在宿主的免疫反应中起着改变调节的作用。
3、结核分枝杆菌以固有的细胞免疫成分为靶点：
（1）EIS 靶向并乙酰化丝裂原活化的蛋白激酶磷酸酶-7（MKP-7）来阻止宿主 JNK 依赖的免疫应答。
（2）MPT53 可以直接氧化 TAK1 上的硫醇，以促进 TAK1 介导的宿主超炎症免疫反应。
（3）分泌蛋白PPE2通过SH3样结构域直接与宿主 NADPH 氧化酶的胞质亚基 p67phox 相互作用，抑制 ROS 的产生，有利于 Mtb 在巨噬细胞内的存活。
接下来和大家分享刘翠华教授团队的一篇研究论文，是与北京师范大学邱小波教授团队以及微生物研究所高福院士团队最新合作发表在 EMBO reports 上的题为“Mycobacterium tuberculosis protein kinase G acts as an unusual ubiquitinating enzyme to impair host immunity”一文。
该文揭示了 Mtb PknG 可与宿主泛素系统的另一种关键蛋白——泛素耦合酶（E2）UbcH7 发生特异性结合，并催化一种非经典的两步泛素化级联反应来靶向调控宿主泛素系统，进而抑制宿主的固有免疫应答。
研究发现 Mtb PknG 是具有非经典的泛素激活酶（E1）和泛素连接酶（E3）活性的效应蛋白（且揭示了 PknG 可通过两步介导底物的泛素化修饰），并可利用其双功能酶活性促进宿主细胞中的 TRAF2 和 TAK1 的泛素化及降解，最终抑制 NF-κB 固有免疫信号通路的活化，从而促进病原体在细胞内生存。
一、Mtb PknG与E2蛋白UbcH7互作
本研究通过酵母双杂交方法、免疫沉淀、pull down 等实验，证明 E2 蛋白 UbcH7 与 pknG 蛋白互作。
图2-1 Mtb PknG通过Ubl结构域与E2蛋白UbcH7相互作用。
二、PknG具有非经典E1异肽酶活性
体外泛素偶联实验，发现 PknG 可以作为一种非经典的 E1，利用 ATP 作为能量来源，促进 Ub 在 UbcH7 上的结合。对PknG 催化的 UbcH7 偶联的时间过程分析进一步发现，在30分钟内，UbcH7 偶联的水平随着时间的推移而增加（图2-2）。
图2-2 体外泛素偶联实验
与传统的 E1 不同，PknG 可以直接催化 Ub 偶联到 UbcH7 上，绕过 PknG-Ub 键合步骤（图2-3）。
图2-3 Mtb PknG体外催化Ub与UbcH7结合
注：PknG K181M，无活性激酶突变。
Lys82 为 PknG 催化 Ub 结合至 UbcH7 的位点，其间无需形成硫酯键连接的 PknG-Ub 中间体，而经典的 E1 通常催化 Ub 以硫酯键的形式结合至 UbcH7 的 Cys86 位点，且其间需要形成硫酯键连接的 E1-Ub 中间体（图2-4A）。
图2-4 Mtb PknG是具有异肽酶活性的非经典E1酶活
PknG 具有 Ubl 结构域依赖的非经典 E1 活性，可以在 ATP 存在下直接催化 Ub 偶联到 UbcH7 的 Lys82 上，从而取消 UbcH7 的典型 E2 活性。进一步实验表明， PknG 具有依赖于 Ile87 残基的异肽酶活性（催化 Ub 自 UbcH7-Ub 复合物上解离）（图2-4B、C）。
三、Mtb PknG通过抑制NF-κB激活来抑制宿主先天免疫
Mtb PknG 是否调节宿主固有免疫信号通路，在 HEK293T 细胞中对 PknG 及其突变基因进行荧光素酶报告实验，PknG 可显著抑制 TNFa 诱导的 NF-κB 信号通路，E190A 突变消除了 PknG 介导的 NF-κB 激活的抑制（破坏 PknG 和 UbcH7 之间的相互作用），而其它 PknG 突变（K181M、PknG ∆TPR），没有引起这种影响（图2-5 A)。
图2-5 Mtb PknG以E190位点依赖的方式抑制NF-κB的激活
构建敲除菌株 Mtb ∆pknG、回补菌株，通过 qPCR、ELISA 检测结核感染巨噬细胞过程中细胞因子的表达是否受 Mtb PknG 或其突变体的调控。
PknG 的缺失促进了 TNF 和 IL-6 等炎症因子的产生（图2-5B、C），降低了巨噬细胞中的细菌存活率（图2-5D），这表明 PknG 抑制了炎症因子的产生，提高了细菌的细胞内生存。
E190A 突变基本消除了 PknG 介导的对巨噬细胞中细胞因子产生的抑制作用（特别是在感染后0-8 h），而 K181M 突变部分消除了 Mtb PknG 介导的对巨噬细胞中细菌存活的抑制作用（特别是在感染后8 h）。
PknG E190A 和 K181M 双突变 Mtb 菌株 (DpknG:PknG K181M,E190A) 比 DpknG:PknG K181M 和 DpknG:PknG E190A 菌株表现出更高的细胞因子产量和更低的细菌负荷，特别是在感染后8-24 h（图2-5 B-D)。
以上结果表明，Mtb PknG 能够以依赖于其 Ubl 结构域的方式特异性抑制 NF-κB 激活。
四、Mtb PknG具有非经典E1和E3活性，促进TRAF2和TAK1的降解
在 HEK293T 细胞中对 PknG 进行荧光素酶报告实验，结果表明，PknG 抑制了 TAK1 或 TAB1 介导的 NF-κB 激活(图2-6 A)。转染 HEK293T 细胞和感染巨噬细胞的免疫共沉淀分析进一步证明 PknG 与 TRAF2 和 TAK1 相互作用（图2-6 B-C）。在 WT Mtb 或 Mtb ∆pknG:PknG 株感染的 U937 细胞中，TRAF2 和 TAK1 的蛋白水平显著降低，但在 Mtb ∆pknG 或 Mtb ∆pknG:pknG E190A 菌株种并没有降低（图2-6 D）。这种作用在蛋白酶体抑制剂 MG132 处理的细胞中被消除（图2-6E），从而表明 pknG 介导的 TRAF2 和 TAK1 蛋白水平的下降是由蛋白酶体降解引起的。
图2-6 Mtb PknG通过与UbcH7结合，靶向TRAF2和TAK1降解
综上所述，PknG 可能通过与 UbcH7 相互作用促进 TRAF2 和 TAK1 的蛋白酶体降解。
研究 PknG 对 TRAF2 和 TAK1 的 E3 活性，通过体外泛素化实验，在 PknG 或 PknG P57A 突变体存在时，TRAF2 和 TAK1 明显泛素化，但在 PknG E190A 突变体存在时，没有泛素化发生（图2-7 A和B），从而表明 PknG 拥有 E3 活性促进 TRAF2 和 TAK1 的泛素化。可见 WT PknG 和 PknG K181M 突变体促进了感染巨噬细胞中 Ubch7 依赖的 TRAF2 和 TAK1 的多泛素化（图2-7 C和D）。UbcH7 和 Ub 添加到纯化的 TRAF2 或 TAK1 蛋白中，促进了在 WT PknG 存在下的 TRAF2 或 TAK1 的泛素化（图2-7 E和F）。PknG 促进了 k48 连接的 TRAF2 和 TAK1 的多泛素化，而不是 k63 连接的泛素化（图6G和H），进一步证实了 PknG 的活性依赖于与 UbcH7 的相互作用（图2-7H）。
图2-7 Mtb PknG依靠Ubch7结合促进TRAF2和TAK1的lys48连接多泛素化
综上所述，表明 Mtb PknG 通过非经典的 E1 和 E3 活性促进 TRAF2 和 TAK1 泛素化，最终导致其泛素化降解并抑制 NF-κB 通路。
五、Mtb PknG在体内抑制分枝杆菌的免疫应答
构建感染 WT Mtb 和不同 PknG 突变体的 Mtb 菌株的小鼠结核模型，在感染后0、5、10、15 和20天采集肺、肝和脾进行分析。qPCR 脾细胞的分析表明,与 WT 感染小鼠的脾脏相比，感染 pknG E190A 显著增加肿瘤坏死因子和 IL-6 的 mRNA 水平（图2-8 A和B）。CFU 计数和 HE 染色评估肺和肝脏病理变化，与 WT Mtb 菌株相比，感染后10天，∆pknG:pknG E190A 菌株在肺部的细菌负荷和肺部和肝脏的细胞浸润均下降（图2-8 C和D）。这些数据表明，UbcH7 结合依赖的 PknG 的 E1 和 E3 酶活性有助于抑制体内先天免疫应答。
图2-8 Mtb PknG在体内抑制分枝杆菌的免疫应答
综上，该文创新性研究成果刷新了对已有泛素化催化机制的认识，揭示了一种病原菌靶向宿主泛素系统的新策略，提供了基于病原-宿主界面的抗结核治疗新靶点（即 Mtb PknG 的非经典 E1 和 E3 酶活相关的 Ubl 结构域，该结构域与非致病性分枝杆菌及宿主细胞间几乎无同源性）。
图2-9 MtbPknG催化非经典两步泛素化级联反应抑制宿主固有免疫模式图
晶诺可提供的分枝杆菌-宿主细胞相互作用研究方面的相关实验内容：
常用巨噬细胞
THP-1、Raw246.7等。
常用分枝杆菌
耻垢分枝杆菌、BCG、H37Ra、H37Rv功能基因敲除、过表达和回补突变体文库。
研究内容
结核菌-宿主互作（结核菌某基因作用）、某基因与易感性研究、药物作用等方面。
欢迎各位老师交流和咨询
文章链接
[1] New insights into the evasion of host innate immunity by Mycobacterium tuberculosishttps://www.nature.com/articles/s41423-020-0502-z
[2] Mycobacterium tuberculosis protein kinase G acts as an unusual ubiquitinating enzyme to impair host immunityhttps://www.embopress.org/doi/epdf/10.15252/embr.202052175
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