转录组学是功能基因研究的重要组成部分，是一门在整体水平研究基因功能、基因结构、揭示基因转录、转录调控规律以及疾病发生过程中的分子机理的学科。随着下一代测序技术的快速发展及平台的市场化，转录组学测序技术已经彻底改变了转录组学的思维方式。目前，成熟的转录组学测序技术以其整体性、系统性、个体组织差异性、时间独立性等优势，更好地推动转录组学研究。
应用转录组学测序技术针对结核分枝杆菌在体外或体内不同环境下各基因表达水平进行研究，通过生物信息学分析差异表达基因功能，进行功能分类，更有效地研究各种因素刺激对结核分枝杆菌的影响机制。下面通过对几篇文献的解读，带大家了解一下结核分枝杆菌脂质相关的转录组学分析与应用。
流程：总RNA提取→样品检测→建库→上机测序→生物信息学分析
文献解读1：通过RNAseq分析富脂条件下结核分枝杆菌的转录组学
实验设计
测定结核在富含脂质条件下有氧和低氧的转录组差异，以添加葡萄糖为碳源作为对照，通过转录组测序技术检测在胆固醇、棕榈酸、硬脂酸、油酸混合物为碳源诱导下结核分枝杆菌在生长的3个代谢阶段（指数期、平台期、NRP1期）的转录差异。
| 实验组（脂质为碳源） | 对照组（葡萄糖为碳源） |
|---|---|
| 有氧指数生长期（LE） | 有氧指数生长期（DE） |
| 有氧平台期(LS) | 有氧平台期（DS） |
| 缺氧持留期(LNRP1) | 缺氧持留期（DNRP1） |
注：non-replicating persistence stage 1 of hypoxia (NRP1)，在缺氧条件下，结核分枝杆菌不复制持留阶段。
生物信息学分析
DS样本的反义reads高于其他样本（图1-1A）,深度测序结果显示在DS、LS、LNRP1样品中非编码RNA含量较多（图1-1B）。图1-2为主要成分分析和聚类热图。
图1-1 RNAseq检测结果
图1-2 主要成分分析图
脂质条件下不同基因表达分析
结果显示有368个基因表达量变化，183个基因表达量减少，185个基因的表达量增加（图1-3A）。图3B为主要成分分析和聚类热图，通过不同碳源（脂质和葡萄糖）及生物重复聚集。差异基因功能分类（图1-3C）：大部分属于假设性蛋白、细胞壁和细胞过程、细胞代谢和呼吸以及附加分类（IGR和sRNA）。结果表明，脂质的存在促进脂类代谢类、中间代谢类、呼吸类基因表达（图1-3D）。
图1-3 脂质条件下结核分枝杆菌差异基因表达
脂质条件下结核分枝杆菌不同生长阶段各基因表达分析
以葡萄糖为碳源做对照，脂质为碳源的条件下，在LE阶段差异表达基因有1241个（其中557个下调，684个上调）；在LS阶段差异表达基因有2043个（其中1196个下调，847个上调）；在LNRP1阶段差异表达基因有138个（其中43个下调，95个上调）（图1-4）。
图1-4 脂质条件下不同生长阶段的差异基因表达
如图1-5所示，表示每类功能基因表达差异上下调数目，差异最多的类别有：保守假设蛋白、细胞壁和细胞过程、代谢和呼吸以及附加分类（IGR和sRNA）。图5B为不同功能类别分析。通过此分析，可对每个生长阶段的基因上下调类别分类。在LS和LNRP1阶段，PE/PPE的表达量明显下降，而相关脂质、中间代谢和呼吸的基因表达量明显上调。在LS阶段，信息通路及细胞壁和细胞过程这两类表达上调，在LNRP1缺氧阶段，毒力和调控蛋白表达上调。在LE阶段只有信息通路相关类别表达明显下调。
图1-5 脂质条件下不同生长阶段的差异基因的功能分类
主要的核心脂质反应
图1-6为脂质诱导的基因数目，展示了在脂质条件下表达量显著增加基因。中心的重叠区域为在三个阶段表达量都明显升高的基因，称为核心脂质反应，有6个基因分别为：Rv3161c、Rv3160c、Rv0678、Rv1217c、PPE53和che1。
图1-6 脂质诱导的核心基因
qPCR验证
选择10个在脂质条件下明显上调基因，通过qPCR验证。其中7个基因为Rv3160c、Rv3161c、PPE53、che1、mmpS5、hsd4A和usfY（DGE分析在脂质三个阶段均上调基因）,另外3个为hrp1（LE阶段增加）、Rv1639c（LS阶段增加）、Rv0560（LNRP1阶段增加）。测定这10个基因的绝对表达量（以16s RNA为内参）（图1-7A），以葡萄糖为碳源做对照组，脂质条件下各基因表达量（图1-7B）。
图1-7 qPCR验证脂质条件下基因表达差异
qPCR结果与上述转录组学结果一致，其中hrp1、Rv1639c和Rv0560分别在LE、LS和LNRP1中表达最多，PPE53在LS阶段，che1在LE阶段无统计学意义。
转录组学数据表明，脂质作为碳源可诱导核心脂质反应。6个核心脂质反应基因与耐药、铁的获取及硫减少相关，代谢通路如图1-8所示。在细胞壁和呼吸抑制剂存在的情况下，也发现了Rv3160c-RV3161c和PPE53的相关过表达。mmpL5–mmpS5不仅与耐药相关，也与铁蛋白转运相关。另一个与铁利用相关的平均核心脂质反应基因是che1，其编码产物是铁螯合酶。Rv1217c被预测为Rv1216c、Rv1217c、Rv1218c和Rv1219c操纵子的一部分，在脂质存在的情况下，它们的表达量提高。同样，该操纵子在药物存在时与mmpS5-mmpL5共同表达。同样重要的还有外排泵编码基因mmr和硫还原操纵子(Rv2391-Rv2394)的过表达，在本研究中，所有这些基因都以某种方式联系在一起，并且在脂质存在的情况下显著过表达。根据本研究推测结核分枝杆菌利用脂质为碳源合成新的脂质及细胞壁重构。本研究中脂质也诱导了非编码基因的过量表达，也证实了之前的研究，ncRNA与结核存活密切相关。
图1-8 核心脂质反应激活的主要代谢通路
随着越来越多的研究证实了脂质在结核病病理过程中的重要性，核心脂质反应可能为我们提供一些线索，以确定Mtb代谢中的相关途径，并找到更好的治疗靶点，用于结核病患者的抗生素和疫苗开发以及更好的治疗方案。
文献解读2：mmpL3基因沉默对结核分枝杆菌基因表达的影响
实验设计
四环素诱导的方法对必需基因mmpL3敲低后，检测mmpL3敲低菌在胞内、胞外的生存能力，对mmpL3敲低菌株脂质成分分析，通过RNAseq检测该基因表达量对结核分枝杆菌基因转录水平的影响。
构建四环素介导(tet-off)的mmpL3基因敲低菌株
将四环素诱导的敲低菌株命名为TB416，mmpL3为必需基因，添加四环素后，对mmpL3基因的表达具有抑制作用，TB416在500ng/mL浓度四环素的平板上不能生长，如图2-1A所示。液体培养时，添加四环素对生长具有明显的抑制作用，如图2-1B所示。
图2-1 添加四环素对敲低菌株生长影响
注：●为ATC 500ng/mL;■为ATC 100ng/mL;▲无ATC添加。
敲低菌株TB416脂质成分分析
对添加ATC和不添加ATC培养96小时的敲低菌株、野生型菌株的脂质定性鉴别，mmpL3基因敲低后导致细胞膜成分变化，TDM的减少和TMM的累积较为明显，如图2-2所示。
图2-2 mmpL3敲低菌株TMM的累积
TB416感染巨噬细胞
将菌株TB416侵染THP-1巨噬细胞后，在培养基中添加ATC（200ng/mL），降低mmpL3的表达量，评估mmpL3基因表达与结核分枝杆菌在细胞生长中重要性。如图2-3所示，添加ATC的TB416胞内载菌量与野生菌株一致，添加ATC的TB416在第4天菌量与野生菌比较减少100倍，显示mmpL3基因是结核分枝杆菌在胞内生长、存活所必需的。
图2-3 mmpL3基因敲低菌株在巨噬细胞内存活情况
注：●为亲本菌株TB38；■为无ATC添加的TB416;▲培养基中添加ATC（200ng/mL）的TB416。
转录组测序
结核分枝杆菌添加四环素后抑制mmpL3基因表达，进行转录组测序，了解该基因生物功能。ATC诱导的TB416导致47个基因表达量上调，23个基因表达量下调（3倍以上），从中选择了5个基因（2个上调，3个下调）qPCR验证转录数据。
生物信息学分析
在47个上调基因中，有26个基因是位于9个相邻基因簇中，并协同转录。Rv1057为上调最高的基因（11.8倍），该基因编码一个未知功能的β螺旋结构蛋白，据报道该基因在结核分枝杆菌受到表面胁迫被诱导，并受MprA、SigE基因的调控。铜诱导mmpL3缺失时导致上调的基因称为cso操纵子，编码铜运输系统，cadI、arsC（编码假定金属转运体），Rv2963（编码假定ABC通透酶），mymT (编码金属硫蛋白，保护细胞免受铜中毒)，mmcO（编码耐铜所必需的多铜氧化酶），lpqS-cysK2-rv0849-rv0850操纵子,对毒力和铜抗性至关重要。这些数据表明，MmpL3的表达量影响细胞通透性，扰乱金属稳态，从而影响细胞质氧化还原电位。
Rv0516c(渗透蛋白A)参与渗透信号途径（包含pknd、sigF），调节肽聚糖架构，推测mmpL3表达减少，脂质成分改变，导致表面通透性改变，使细胞受到渗透压胁迫。与此假设一致，argC基因上调3.9倍（精氨酸合成操纵子的第一个基因），精氨酸是一种渗透保护剂。iniBAC操纵子，常见的细胞壁应激操纵子，加入EMB和INH后细胞壁合成受到抑制。
上调基因还包含几个转录调控因子，whiB6（调节ESX-1和DosR调节子对NO反应，从而调节肉芽肿形成和毒力）和whiB7（调节几种耐药基因）。推测MmpL3的耗竭影响结核分枝杆菌毒力及药物敏感性。
在被抑制3倍以上的基因中最多的功能类别是脂质代谢。在23个下调基因中15个基因在6个基因簇上共转录，毫无疑问，下调最多的为MmpL3，同时编码分枝菌酸、TDM生物合成相关几个基因下调（如acpM-kasA-kasB、fbpB），推测TMM的累积，存在反馈机制下调这一生物合成途径。其它被抑制基因参与能量生产如sdaA参与丝氨酸糖异生，atpB编码ATP合成酶，nuoB、D、H编码NADH脱氢酶的不同亚基，mce1操纵子，推测它编码了一个脂质再摄取系统，使菌酸能够循环利用，这表明细胞的代谢活动减少了。
对以上数据的分析，表明MmpL3的缺失导致了表面通透性的改变，可能是由于不能正确地构建细胞壁，导致渗透胁迫和金属稳态的破坏，这些是MmpL3缺失影响细胞活力的主要机制。
转录组学常用应用套路图：
针对药物作用机制、耐药机制的研究，找到核心靶点基因后，进一步深入的后续研究可以考虑，通过对该基因的敲除或过表达菌株构建，验证该菌株对药物的MIC是否发生变化，从而进一步确定该靶点。
参考文献：
1. Diana A. Aguilar-Ayala, Laurentijn Tilleman,et al.The transcriptome of Mycobacterium tuberculosis in a lipid-rich dormancy model through RNAseq analysis. scientific reports.2017;7:17665
2. Giulia Degiacomi, Andrej BenjakJan Madacki, et al. Essentiality of mmpL3 and impact of its silencing on Mycobacterium tuberculosis gene expression.scientific reports. 2017; 7: 43495.
结核转录组学相关文献共享：
1. Genome-Wide Transcriptional Responses of Mycobacterium to Antibiotics.
2. Small RNA profiling in Mycobacterium tuberculosis identifies MrsI as necessary for an anticipatory iron sparing response.
3. The transcriptome of Mycobacterium tuberculosis in a lipid-rich dormancy model through RNAseq analysis.
4. Essentiality of mmpL3 and impact of its silencing on Mycobacterium tuberculosis gene expression.
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