近年来，组学技术的迅速发展和广泛应用，开启了生物医学领域研究的新篇章。全基因组测序技术、蛋白质组学技术、代谢组学技术、转录组学技术等，产生海量数据，通过生信分析及数据统计等方法对数据进行解析，把数据转化为科学假设，并对科学假设设计针对性实验进行验证，实现大数据的科学和实用价值。整合多组学数据，可应用于诸多相互联系和作用的生物成分来研究复杂生物过程的作用机制，系统性研究生物系统中所有组成成分（基因、RNA、蛋白质和代谢产物等）的构成以及在特定条件下这些组分间的相互作用和关系，并分析生物系统在某种或某些因素干预扰动下在一定时间内的动力学过程及其规律。
整合多组学技术应用于结核病研究，为结核致病机制、抗结核药物开发、诊断、治疗等方面的研究提供了新思路。可应用于结核分枝杆菌应激、药物作用等条件下的变化信息，通过多组学综合分析，阐释结核病复杂的致病、耐药和免疫应答机制。今天和大家分享一篇应用多组学技术阐释结核分枝杆菌重要代谢途径的文章。
文献解读 | 结核分枝杆菌的乳酸和丙酮酸代谢
营养物质是结核菌和宿主细胞相互作用的一个关键方面，脂肪酸是结核菌的主要碳源，然而在可溶性营养素中还存在着其他可替代碳源，如乳酸和丙酮酸。人体富含乳酸和丙酮酸，特别是在炎症期间。本研究使用多组学技术（转座子定向插入位点测序、转录组、蛋白质组、同位素标记与质谱的代谢组等），研究乳酸和丙酮酸在结核分枝杆菌内的代谢途径。
乳糖和丙酮酸作为碳源
图1 乳糖和丙酮酸作为碳源Mtb的生长情况
Mtb不同供应量（0.1%、0.4%）在乳酸和丙酮酸作为碳源的培养基中生长速率相似，而以葡萄糖为碳源Mtb生长速率较慢（图1-A、B）。而Mtb在脂肪酸作为碳源的生长能力随着脂肪酸浓度及碳链长度的增加而减弱（图1-C-F）。以上结果表明，Mtb可有效利用乳酸、丙酮酸作为碳源。
乳酸、丙酮酸的代谢网络研究
将在甘油、葡萄糖为基础的培养基中培养的Mtb转移到分别以乳酸、丙酮酸和葡萄糖为碳源的培养基中，培养24h。
图2 转录组学和蛋白质组学分析
以葡萄糖做对照组，分别对三组菌株的转录组和蛋白质组进行分析，结果表明以乳酸和丙酮酸为碳源的培养，诱导了整体变化（图2-A）其中脂代谢类别相关的转录本、蛋白质最多，表明脂代谢发生了显著的重构。其中乳酸和丙酮酸的转录本、蛋白质水平并不完全重叠（图2-B），表明两种高度相似的碳源反应并不相同。
乳酸、丙酮酸表现出相同的调控趋势（上调或下调），pckA、icl1、prpC、prpD转录本和蛋白质都显著上调，frdABCD操纵子、frdA下调。prpR是prpDC操纵子的正调控因子，在转录和蛋白水平上也上调(图2-C-G)，这些基因变化表明，Mtb使用乙醛酸分流和甲基柠檬酸循环降解乳酸和丙酮酸，pckA可能用于引导草酰乙酸进入糖异生(图2-H)。
在丙酮酸中，aceAa上调，而乳酸中并没有，表明异柠檬酸裂解酶活性较低。在乳酸中，glkA、mez转录量上调，在丙酮酸中没有。
乙醛酸分流
基于以上组学实验，Mtb在乳酸、丙酮酸为碳源环境下，提出科学假设：是否由于icl1基因导致异柠檬酸裂合酶活性增加？为了验证这一点，分别提取以葡萄糖、乳酸、丙酮酸为碳源的Mtb游离蛋白，测定异柠檬酸裂合酶活性，结果显示在乳酸、丙酮酸培养的Mtb的异柠檬酸裂合酶活性明显高于葡萄糖培养的菌株（图3-A）。当所有碳源含量为0.1%时，异柠檬酸脱氢酶活性相似；在碳源增至含量0.4%时，乳酸和丙酮酸中的酶活性明显增加，而葡萄糖中无变化（图3-B)。这些结果表明，乙醛酸分流通量的增加并不伴随着Krebs循环通量的减少。
图3 异柠檬酸裂解酶活性检测
由于7H9液体培养基中含BSA，可能会被利用作为碳源。为验证异柠檬酸裂解酶活性增加是由于乳酸、丙酮酸引起，使用不含BSA的培养基重复实验。结果再次显示，乳酸、丙酮酸仍会诱导异柠檬酸裂解酶活性提高（图3-C）。与酶活性结果趋势一致，当使用不含BSA的培养基时，Mtb的生长以乳酸、丙酮酸作为碳源仍优于葡萄糖（图3-D）。
乳酸、丙酮酸在Mtb中的复杂代谢
质谱跟踪CCM代谢物标记，13C分别标记碳源葡萄糖、乳酸、丙酮酸，Mtb在不同碳源中培养3h、16h时进行检测。
图4 代谢组学分析乳酸和丙酮酸能量代谢网络
结果表明，乳酸和丙酮酸均通过Krebs循环、甲基柠檬酸循环、GABA分流和糖异生有效代谢（图4）。与琥珀酸（SUC）相比，富马酸（FUM）减少可能是由于富马酸还原酶（frdABCD）下调（图2D、F），并表明琥珀酸优先进入甲基柠檬酸循环。与富马酸比，苹果酸的标记可能源于乙醛酸分流，也可能源于苹果酸酶（mez）将丙酮酸转化为苹果酸。值得注意的是，乌头酸（cis-ACO）的减少与大量α-酮戊二酸并不相容。可能是由于乌头酸来源于未标记代谢物，或者由于α-酮戊二酸来源于其他替代途径或储存，如GABA分流或α-酮戊二酸氧化还原酶。乳酸、丙酮酸作为碳源与甲基柠檬酸结合证实Mtb通过甲基柠檬酸循环代谢非脂质碳源。
为了更好地理解乳酸和丙酮酸代谢途径的运作，分析Krebs循环、乙醛酸分流和甲基柠檬酸循环的早期时间点(0.5和1 h)的单个同位素(图5、图6)。
图5 代谢物总标记
注：其中图b上下两图为两次独立实验。
图6 同位素分析通过不同途径丙酰辅酶a的产生
注：M+后面表示被标记的炭原子个数，用于区分代谢通路。
结果表明：
1、柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸与通过Krebs循环氧化分枝的乳酸、丙酮酸代谢流相匹配。
2、13C标记含量:柠檬酸>琥珀酸>α-酮戊二酸。
3、富马酸与琥珀酸不兼容，M+2无富马酸，说明富马酸不再消耗和合成，琥珀酸转移到其它地方，如甲基柠檬酸途径。琥珀酸大多数都有，但富马酸只有M+1中有，M+2中有苹果酸，表明来自乙醛酸分流（通过苹果酸合成酶）。丙酮酸为碳源（图6B），M+3中无苹果酸，说明苹果酸由乙醛酸分流产生。
4、甲基柠檬酸标记与琥珀酸衍生物和丙酮酸衍生物M+2、M+3、M+4一致。
5、甲基柠檬酸盐和丙酸盐同位素分布不完全匹配，与丙酸盐相比，甲基(iso)柠檬酸盐的标记程度较低（图5A），并且在乳酸(图6A)和丙酮酸(图6B)中，M+3丙酸盐丰度高于甲基柠檬酸盐M+3、M+5、M+6和M+7。这些结果表明，丙酸盐不仅是通过甲基柠檬酸循环产生的。
6、甲基(iso)柠檬酸盐的标签与丙酸盐M+1和M+2不符。这些结果再次表明，来源于丙酰辅酶a的丙酸盐至少是通过另外一条途径合成的。
结合组学数据及后续针对性的实验设计结果阐释了乳酸和丙酮酸作为碳源时甲基柠檬酸循环激活，在结核分枝杆菌中碳同化和丙酰辅酶a产生循环逆转途径。此外，发现另一个涉及MmsA的通路似乎也参与了Mtb中丙酰辅酶a的形成。
本文还通过转座子突变文库筛选，鉴定乳酸、丙酮酸培养所必需的基因。其中pckA基因是基因、转录本、蛋白质组筛选得到的，为进一步确定pckA基因在乳酸、丙酮酸代谢中作用，构建pckA基因敲除菌株，在0.1%和0.4%乳酸或丙酮酸为碳源的培养基中，敲除菌株不生长，而在0.1%和0.4%葡萄糖培养基中，敲除菌株正常生长。在乳酸、丙酮酸为碳源的培养环境下，pckA基因为生长所必需。在乳酸、丙酮酸碳源浓度4%的培养环境下添加异柠檬酸裂解酶抑制剂（3NP），对Mtb生长有着明显抑制作用，而在葡萄糖中生长无此现象，进一步构建icl基因敲除菌株，结果与3NP结果一致。进一步确定了在乳酸、丙酮酸为碳源的培养环境下，icl基因为生长所必需。
质谱检测人巨噬细胞胞内、胞外（培养基）中乳酸及丙酮酸含量，发现胞内含丰富的乳酸、丙酮酸。估算巨噬细胞内乳酸的浓度为0.56~6.7 mM，丙酮酸的浓度为0.03~0.34 mM。关于人巨噬细胞的数据表明，乳酸和丙酮酸都是巨噬细胞内丰富的碳源，推测乳酸和丙酮酸可以被细胞内和细胞外的Mtb利用。
结论：
如图7所示，本文揭示了Mtb利用乳酸、丙酮酸代谢的网络，其中最显著的是乙醛酸分流和逆向甲基柠檬酸循环。除了甲基柠檬酸循环外，还有另一种由乳酸和丙酮酸产生丙酰辅酶a的活性途径，可能与甲基丙二酸脱氢酶(MmsA)有关。乳酸和丙酮酸等碳源可能是Mtb首选底物，且较脂肪酸相比，可能实现更高的生长速率和生物通量，从而认为结核感染期间对乳酸和丙酮酸的利用是至关重要的。
图7 在Mtb中乳酸和丙酮酸代谢网络
参考文献：
Agnese Serafini, Lendl Tan, Stuart Horswell, et al. Mycobacterium tuberculosis requires glyoxylate shunt and reverse methylcitrate cycle for lactate and pyruvate metabolism. Molecular Microbiology (2019) 112(4), 1284–1307.
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