结核病（TB）是由结核分枝杆菌（MTB）感染引起的严重威胁人类健康的慢性传染病。结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis， MTB）具有细胞壁较厚，脂肪酸含量较高和抗原成分复杂的结构，这些特征对MTB的致病性和耐药性起着关键作用。此外，人类错综复杂的生活方式及 MTB 多途径传播的流行病学特征等因素相互作用，增加了机体防御 MTB 感染的难度。耐药结核病与其他传染病合并感染给全球公共卫生带来巨大挑战。
目前，在针对结核分枝杆菌的单基因生物学及其病原学功能研究问题领域中，通常定向构建目的基因敲除突变体是解决此类问题的最直接、最优先、最基本的方法学。
构建单基因敲除突变体菌株的常用遗传学操作手段中，以噬菌体为载体介导的同源重组法相对最为成熟，也最被世界范围内同行专家广泛肯定和使用。晶诺生物已利用此工具成功得到结核分枝杆菌的单基因敲除突变体菌株库。但是，此法所依赖的分子操作工具之一——噬菌体包装蛋白目前已停产，并且其后续生产计划未知。鉴于此，替代型遗传学操作工具急需整理推新。
经长时间测试检验和质粒优化改造，晶诺生物推荐两种新的分枝杆菌基因敲除方法：pJV53介导的同源重组法及其变种pYS1介导的同源重组法。
pJV53介导的同源重组法
技术原理与实验步骤
首先电转pJV53至分枝杆菌中，从而获得重组工程菌株并制备成感受态细胞；同时Overlap PCR构建双链DNA同源交换序列，将此产物电转至感受态细胞后涂布到含抗生素的固体培养基上，37℃培养（不同菌种需不同时间），挑取单克隆，通过PCR等方式进行验证。
pJV53基因敲除技术流程图
基因敲除验证示例
pJV53基因敲除示意图
pJV53基因敲除菌株基因组验证PCR
Line 1: M.smegmatis WT
Line 2、3、4、5、6、7: M.smegmatis Δ4258基因敲除菌株
M: Marker
红色箭头代表PCR验证正确片段大小
基因融合验证示例
pJV53基因融合示意图
pJV53基因融合绿色荧光检测
左：野生型对照 右：突变株
pJV53基因融合菌株基因组验证PCR
Line 1: M.smegmatis WT
Line 2: M.smegmatis MSMEG-4258-gfp
M: Marker
pYS1介导的同源重组法
技术原理与实验步骤
首先电转pYS1至分枝杆菌中，从而获得重组工程菌株并制备成感受态细胞；同时Overlap PCR构建双链DNA同源交换序列，将此产物电转至感受态细胞后涂布到含抗生素的固体培养基上，37℃培养（不同菌种需不同时间），挑取单克隆，通过PCR等方式进行验证。
pYS1基因敲除技术流程图
基因敲除验证示例
pYS1基因敲除示意图
pYS1基因敲除验证图
Line 1: M.smegmatis WT
Line 2、3、4、5、6、7: M.smegmatis Δ4258基因敲除菌株
M: Marker
红色箭头代表PCR验证正确片段大小
pYS1方法 VS pJV53方法的重点差异
pYS1方法可通过调控菌株培养温度丢失pYS1质粒，使得获得的最终突变菌株仅在基因组上发生基因缺失，不再携带额外质粒，最终产物与噬菌体同源重组方法获得的突变菌株无本质差异。
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