关注晶诺生物的朋友们应该对我们的“招牌”——结核分枝杆菌基因敲除技术服务比较熟悉了，也对接着推出的结核分枝杆菌全基因组测序和结核分枝杆菌重要免疫原蛋白产品有一定的了解。现在，结核分枝杆菌蛋白质组学检测分析服务也跟大家见面啦！接下来带大家了解一下蛋白质组学以及蛋白质组学定量分析针对于结核的应用。
一、蛋白质组学介绍
1. 蛋白组学
从整体的角度，分析细胞内动态的蛋白质组分成分、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的互作与联系，是揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律的一门新的科学技术。
2. 实验流程
加标签：样品—蛋白质提取—酶解—加标签—混合上机—质谱定量—生物信息学分析。
Lable-free：样品—蛋白质提取—酶解-单个样品上机—质谱定量—生物信息学分析。
3. 常用定量检测方法
iTRAQ/TMT标签定量：经典主流技术，是差异蛋白质定量分析方法中通量最高、系统误差最小、功能分析最强大的蛋白组学分析方法之一，一次质谱上机可同时对2-10个样本进行检测和比较蛋白表达差异。
Label-free定量：是一种非标记定量方法，用来比较的样品不经过任何标记，直接酶解后经过质谱产生数据，通过软件对谱图进行归一化后，比较对应质谱峰的峰强度，峰面积等一系列因素，来确定蛋白质在几种样本中的相对表达量变化。
4. 信息分析内容
蛋白质鉴定结果、蛋白质定量结果、蛋白质GO功能分类富集、差异蛋白GO富集分析、差异基因列表及数目比较表、上下调基因表及数目比较表、鉴定蛋白理化性质表、差异基因KEGG pathway通路图、网络互作图等。
二、文献解读—M.tb 侵染人巨噬细胞引起宿主反应的定量蛋白组学分析
1. 实验内容
检测结核分枝杆菌非毒性株H37Ra、毒性株H37Rv分别侵染巨噬细胞后，巨噬细胞蛋白质表达水平变化，质谱定量差异蛋白，通过生物信息学分析，对差异蛋白质功能分类分析。这些数据可以更好地了解宿主内M.tb的发病机制，有助于结核病的预防和临床治疗。
实验样品
THP-1巨噬细胞（空白对照）、乳胶微粒beads（阴性对照）、非毒性株H37Ra和毒性株H37Rv分别侵染THP-1巨噬细胞。
侵染后巨噬细胞培养12 h
依据：使用qRT PCR确定被M.tb侵染的巨噬细胞在不同时间点凋亡基因（blf-1）抗凋亡基因（tnf-a）的表达水平，实验表明12小时时两个基因的表达水平较其他时间点高。
标签：TMT lable
THP-1巨噬细胞TMT-126、乳胶微粒beadsTMT-127、无毒H37RaTMT-128、有毒H37Rv TMT-129。
2. 实验流程
实验流程图
THP-1细胞激活—THP-1巨噬细胞感染—感染后培养12小时—蛋白质提取及处理—加TMT标签—混合上机（LC-MS）—生物信息学分析。
3. 蛋白质组学分析结果
TMT标签蛋白质定量分析：将差异表达蛋白（DEPs）比较分为4组，beads/THP-1、H37Ra/beads、H37Ra/beads、H37Rv /H37Ra group，结果如下图所示。
差异蛋白表达聚类分析
beads/THP-1：DEPs主要是与自噬溶酶体和免疫相关蛋白如：LIMP II、CD63、组织蛋白酶G。由于乳胶微粒生理刺激，导致迟发性应激反应产生，从而引发免疫反应及吞噬作用。
H37Ra、H37Rv菌株感染巨噬细胞后I型干扰素诱导蛋白的表达量提高，如ISG15、ISG20、IFIT 1、IFIT 2、IFIT 3、IFIH 1、BST2、IRF9、RSAD2，功能注释为免疫和病原致死相关。
H37Rv /H37Ra：差异蛋白质聚类分析TOP 5分别为氧化还原酶、信号分子、水解酶、酶调制器、核酸结核相关。与H37Ra菌株感染比较，H37Rv菌株感染蛋白表达发生改变最明显的是调亡过程、血凝、核小体组装、氧化磷酸化、囊泡相关蛋白。其中23个蛋白与血凝相关，26个蛋白与凋亡过程相关，19个蛋白与氧化磷酸化相关，其他与囊泡、核小体组装相关。最为显著的是凋亡过程与炎症反应。其中最为明显的蛋白是：AHSG、IL-1B。
蛋白免疫印迹：与H37Ra菌株感染巨噬细胞蛋白质表达水平相比，H37Rv菌株感染巨噬细胞后IL-1B的表达水平减少，AHSG表达水平增多。结果与蛋白质组学分析结果一致。
毒性结核分枝杆菌诱导的巨噬细胞的特异性免疫反应
分别用毒性株H37Rv、非毒性株H37Ra侵染巨噬细胞，通过蛋白质组学分析差异蛋白，有助于我们理解结核分枝杆菌的致病机理。这些结果为进一步研究和治疗结核病毒感染后宿主的反应提供了新的线索。
结核分枝杆菌H37Ra与H37Rv感染巨噬细胞的差异蛋白比较分析：
（1）巨噬细胞胞外诱捕网（MET）主要由组蛋白、DNA组成，巨噬细胞释放MET抑制并杀死结核分枝杆菌，H37Rv菌株侵染巨噬细胞后，可能诱导MET相关蛋白的上调。
（2）凝血与免疫存在交互作用：纤维蛋白调控细胞因子产生和巨噬细胞在机体内黏附，解释了肉芽肿的形成。
（3）H37Rv菌株侵染巨噬细胞后，HLA-A表达水平下降，毒株感染可能干扰T细胞上抗原肽对T细胞受体（TCRs）的表达。
（4）与H37Ra菌株相比，H37Rv菌株感染可诱导巨噬细胞产生更多的超氧化物，超氧化物的主要来源复合物I和III（C I、C III），ROS的生产也可以有助于激活NF-κB和细胞生存，C I、C III蛋白在氧化诱导细胞凋亡中可能起着重要作用。此外，超氧化物可以通过SOD2转化为H2O2。在H37Rv菌株感染巨噬细胞后，SOD2表达下调，SOD2可以破坏超氧阴离子自由基，保护细胞免受氧化诱导的凋亡。
（5）线粒体在产生ROS和ATP的过程中是必不可少的，H37Rv菌株感染巨噬细胞后C V合成，调亡后ATP缺乏导致坏死细胞的死亡。线粒体ATP合成酶的上调可能依赖于细胞凋亡的激活。
（6）线粒体核糖体蛋白与抗凋亡调节因子Bcl-2相互作用，促进细胞凋亡。与H37Ra菌株感染相比，H37Rv菌株感染巨噬细胞后，MRPL4上调导致抗凋亡蛋白降低。另一方面，热休克同源蛋白71 kDa （HSPA8）通过参与伴侣介导的自噬抑制细胞凋亡。H37Rv菌株通过阻止巨噬细胞凋亡而提高其在巨噬细胞中的存活率。阐明毒性结核分枝杆菌感染可能与线粒体内膜氧化磷酸化有关。
（7）细胞凋亡过程和炎症反应相关的巨噬细胞蛋白表达水平发生改变，AHSG在感染中作为阳性或阴性的急性期蛋白发挥作用，并受不同促炎介质的调节，与H37Ra菌株感染相比，H37Rv菌株感染巨噬细胞后AHSG表达水平显著升高。
（8）NFκB1和NFκB2 NF-κB下调的可能诱发更多的细胞死亡。TRAF1是肿瘤坏死因子的负调节信号，防止NF-κB激活TNF和IL-1，这表明TRAF1可能会上调NF-κB的减少。可能还存在其他机制调控NF-κB通路。另一种蛋白TSG6具有抗炎作用，可由TNF和IL-1诱导。H37Rv菌株可能通过调节免疫因子的表达水平而逃离免疫系统，其机制尚不清楚，值得进一步研究。
综上所述，这些分析表明，与H37Ra菌株感染相比，H37Rv菌株感染可导致与氧化磷酸化、凋亡过程、凝血和核小体组装相关的巨噬细胞蛋白表达。此外，H37Rv菌株感染后巨噬细胞的命运可能取决于这些免疫过程的相互作用。此外，一些DEPs（如AHSG、RBP4和IL-1β）总是位于血清，这可能是致命的感染生物标志物。研究表明，活动性肺结核患者血浆中AHSG和RBP4的表达水平均明显低于非活动性肺结核患者，这两种蛋白在结核分枝杆菌感染后与血清的表达趋势相反，值得进一步研究。
本研究采用基于TMT标记的定量蛋白组学方法，揭示了H37Ra、H37Rv菌株分别感染巨噬细胞蛋白表达谱的差异。这些DEPs主要参与细胞凋亡、凝血、氧化磷酸化等途径，蛋白表达谱的巨大差异表明可能存在以下四种不同的免疫机制：
（1）在H37Rv和H37Ra菌株感染的巨噬细胞中，构成MET的组蛋白和颗粒成分的表达水平均有提高，但前者的作用更为显著，有利于MET的形成，从而捕获结核分枝杆菌。
（2）H37Rv菌株降低巨噬细胞中HLA-A的表达水平，可能干扰巨噬细胞向T细胞TCRs表达抗原肽，从而避免T细胞介导的细胞免疫反应。
（3）H37Rv菌株感染诱导线粒体内ROS过量产生，SOD2表达下调，调节巨噬细胞的凋亡。
（4）H37Rv与H37Ra菌株感染巨噬细胞相比，参与对结核分枝杆菌免疫和调节巨噬细胞凋亡相关蛋白NFκB1、NFκB2、 pro-IL-1β、TNFAIP6、TRAF1的表达水平都减少了。
小结
通过蛋白质组学分析结核分枝杆菌H37Ra、H37Rv感染巨噬细胞后，定量巨噬细胞蛋白表达差异，结果表明：在巨噬细胞表达的6762个蛋白中有235种蛋白质表达水平发生了明显变化，这些蛋白质通过分析分类为：凋亡过程、血液凝固、氧化磷酸化和其他相关蛋白质。感染H37Ra和H37Rv菌株的巨噬细胞之间蛋白谱的巨大差异表明，可能存在四种不同的免疫机制，它们决定了巨噬细胞和结核分枝杆菌的命运。
参考文献：
1. Hua Li, Sha Wei, Yuan Fang, et al. Quantitative proteomic analysis of host responses triggered by Mycobacterium tuberculosis infection in human macrophage cells. Acta Biochim Biophys Sin, 2017, 1–10.
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